GRF (1-29)

[jeanmi 115]

Mise à jour GRF (1-29) a une demi-vie comprise entre 30 minutes et 50 minutes.

CJC-1295 a une demi-vie mesurée en jours.( cjc avec cad )

 

CJC-1293 Mise à jour GRF (1-29)

. Dans Le corps humain en Bonne Santé, de grandes quantites d'hormone de Croissance sont stockées dans L'hypophyse . Les cellules dans Le communiqué de l'hormone hypophysaire de Croissance en Réponse à la signalisation par GHRH (Growth Hormone Releasing Hormone), la ghréline (GHRPs dont - Hormone Releasing Peptides de Croissance - mimétiques SONT), et par SONT inhibées la Libération de la SCÉ Par la somatostatine magasins. . GHRH et d'Agir de la ghréline sur Différentes populations de somatotropes (GH libérant des cellules). . GHRP / ghréline augmente Le Nombre de Libérer somatotropes GH MAIS Pas la Quantité rejetée cellule Every nominale; GHRH qui compre à la Fois Le Nombre de cellules sécrétrices et - Encore plus - le Montant chacune qu'ils sécrètent. [1] GHRH et la ghréline sont libérés dans les habitudes particulières qui varient en fonction de l'événement et l'environnement: après l'exercice, en réponse à la vague de sommeil lent, à certaines étapes de la vie et le développement physique, et ainsi de suite. [1] GHRH et la ghréline SONT DANS Libérés les habitudes Particulières Qui variante en Fonction de l'event et de l'Environnement: Après l'exercice, en Réponse à la vague de sommeil carême, certaines Étapes de la vie et le Développement physique , et «ainsi de suite.

La plupart des gens (même les malades) continuent de posséder la capacité de faire GH dans l'hypophyse. La plupart des gens (meme les Malades) Continuent de posséder la Capacité de faire DANS GH l'hypophyse. Le problème est dans la signalisation de l'hypophyse à libérer et de rendre plus. Dans Le Problème HNE la signalisation de l'hypophyse à Libérer et de plus par rendre. Même la plupart des personnes atteintes de maladies qui affectent la sécrétion de l'hormone de croissance conserver la possibilité de continuer à faire de GH dans leur glande pituitaire. La plupart des same personnes atteintes de maladies affectent la sécrétion Qui de l'hormone de Croissance Conserver de la possibilite de faire Continuer à de GH DANS Leur glande pituitaire. Les états pathologiques et entraîner des symptômes, le plus souvent, dans la libération de GH modifié (dysfonctionnement) de signalisation, ce qui affecte également la capacité de l'hypophyse de continuer à faire plus de GH. Les renvoi à exécution pathologiques et entrainer des Symptomes, le plus souvent, Dans la libération de GH modifié (dysfonctionnement) de signalisation, qui compre CE QUI Also la Capacité de l'hypophyse de Continuer à faire plus de GH. [2] [2]

Endogènes de type GHRH, qui a une quarante-quatre acides aminés à chaîne longue (et une forme spécifique - ce qui en fait un peptide ainsi comme une hormone), a été commercialisé pour la plus longue que Sermorelin en comparaison avec les autres peptides GHRH-type . Endogènes type de GHRH, une ligne Qui Quarante-quatre acides amines à longue chaîne (et Une clichés Spécifique - CE QUI FAIT en peptide hormone de l'ONU AINSI Comme une), un Commercialiser Été Pour la plus longue au Québec en comparaison Sermorelin Avec les autres »peptides GHRH -type. Toutefois, Sermorelin a été démontré à se dégrader rapidement dans le corps et un bon rapport coût-efficacité. Toutefois, une Sermorelin Été démontré une SE dégrader préposition Dans Le Corps et rapports des Nations Unies bon cost-efficiency. Mais parce que la plupart des patients ayant besoin d'une thérapie de GH conservent leur capacité à produire et sécréter leur propre GH, le traitement par un analogue du GHRH-type reste hypothétique préférable d'hormone de croissance exogène. Besoin Maïs Parce Que la plupart des patients «ayant d'Une Thérapie de GH conservent Leur Capacité à Produire et sécréter Leur propre GH, le Traitement analogique par l'ONU hypothétique du GHRH Reste-type préférable d'hormone exogène de Croissance. lui-même lorsqu'il est administré GH exogène entraîne non seulement «contre-nature modes de sortie», il en résulte universellement dans la régulation négative de la production endogène de GH - comme le font de nombreuses hormones lorsqu'il est appliqué de manière exogène. Lui-même lorsqu'il HNE administré GH exogène entraine non SEULEMENT «modes contre-nature de» sortie, il en résulte universellement DANS négative réglementation de la production endogène de la GH - Comme le font de Nombreuses hormones lorsqu'il intérêt appliqué de Manière exogène.



Tout comme la ghréline GHRH et le travail en collaboration par des moyens différents pour la libération de GH maximale dans le corps, GHRH exogène tel que modifié GRF (1-29) se traduit par un effet synergique lorsqu'il est utilisé avec un mimétique de la ghréline, tels que l'hexapeptide connu sous le nom GHRP- 6. Tout Comme la ghréline GHRH et Le Travail en collaboration par des différents moyens »pour la libération de GH Maximale Dans Le corps, GHRH exogène tel Qc GRF modificateur (1-29) par soi Traduit Synergique Effet non mimétique lorsqu'il HNE Utiliser avec un s de La ghréline, tells Comm Que l'hexapeptide nom sous le GHRP-6. [6] Pandya et al concluent également que "GHRH est nécessaire pour la plupart de la réponse de GH à GHRP-6 chez l'homme." [6] Pandya et al Québec concluent Also "Nécessaire HNE GHRH Pour la plupart de la Réponse de GH à GHRP-6 chez l'homme." [6] Massoud et al concluent que «Heraxelin et GHRH-(1-29)-NH2 sont synergiques» [7] (note Ed: Heraxelin est une autre mimétique ghréline). [6] Massoud et al concluent Québec «Heraxelin et GHRH-synergiques SONT (1-29)-NH2» [7] (note Ed: EST UNE Heraxelin mimétique Autre ghréline).


... Sécrétion de l'hormone de croissance se produit dans un rythme réglementé par des interactions complexes entre deux neurohormones: l'hormone de croissance-releasing hormone (GHRH) et du facteur de libération de somatotropine-inhibition (SRIF ).[...] recherches indiquent également qu'il existe des différences sexuelles dans le modèle de libération de l'hormone de croissance et que l'hormone de croissance régule la sécrétion propres au moyen d'un système de rétroaction négative. ... rythme de l'hormone de sécrétion de Croissance se Produit de Dans un regulated par des interactions complexes Entre Deux neurohormones: l'hormone de Croissance-releasing hormone (GHRH) et du facteur de libération de somatotropine-inhibition (SRIF ).[...] recherches indiquent qu'il Also Existe des différences Sexuelles Dans Le Modèle de libération de l'hormone de Croissance et au Québec l'hormone de Croissance régule la sécrétion Propres au Moyen Système des Nations Unies d'négatif de rétroaction. [9] [9]

Par imitation de modèles naturels avec de sortie correctement dosé et datés GHRPs (mimétiques ghréline) et GHRH-analogues, la rétroaction négative et les effets secondaires indésirables qui sont typiquement dans la thérapie de GH synthétique ou même avec les formes passées de l'administration GHRH (comme l'administration à faible dose constante par pompe) peuvent être évités. Par imitation de Modèles naturels Avec de sortie correctement dosé et GHRPs dates (ghréline mimétiques) et GHRH-analogues, la Congruence négative et les Effets Secondaires Indésirables Qui SONT typiquement de Dans la Thérapie de GH synthetic OU same with les clichés passées de l'administration du GHRH (Comme l'administration à une numération globulaire pompe par la dose Constante) may être de évités.

Pour parvenir à des fins autres que la restauration de la libération de GH naturelle chez les patients malades, optimisé dosage rythmique ou pulsatile de GHRH avec ou sans GHRP peut être utile, comme Vittone et al écrire au sujet de leurs conclusions sur GHRH appliquée à la santé des hommes âgés: parvenir Verser une des nageoires Autres Que la restauration de la libération de GH chez les patients naturelle les Malades, la posologie Optimisé unité rythmique pulsatile de GHRH Avec OU sans GHRP Peut être de utile, Comme Vittone et al Écrire au SUJET de conclusions sur LEURS Appliquée à la GHRH Santé des hommes les âges:

... Données suggèrent que la dose unique nocturne de GHRH sont moins efficaces que des doses quotidiennes multiples de GHRH en suscitant GH et / ou des effets de l'IGF-I-médiation. ... Données suggèrent Québec nocturne dose unique de la GHRH SONT Moins efficaces au Québec doses multiples des Quotidiennes de GHRH en suscitant GH et / OU des Effets de l'IGF-I-médiation. traitement GHRH peut augmenter la force musculaire, et il modifie les relations de base entre la force musculaire et la bioénergétique musculaire d'une manière compatible avec un besoin réduit de métabolisme anaérobie au cours de l'exercice. Traitement augmenter Peut GHRH musculaire La force, et il les révisés des relations de base de la force musculaire Entre et la bioénergétique musculaire d'Une Manière compatible Réduit Avec Besoin de l'ONU de métabolisme anaérobie au cours de l'exercice. Ainsi, un traitement optimisé de l'administration GHRH peut atténuer certains des effets du vieillissement sur la fonction du muscle squelettique chez les personnes âgées [10]. AINSI, l'ONU Traitement Optimisé de l'administration Certaine GHRH atténuer Peut des Effets du Vieillissement sur la Fonction muscle squelettique du Chez les personnes [agees 10].

 

 

 

l'hormone de croissance CONTEXTE DE L'INVENTION Dans le début des années 1980 plusieurs groupes isolés et caractérisés facteur de libération (GRF).

GRF (aussi appelé Somatorelin) est un peptide sécrété par l'hypothalamus qui agit sur son récepteur et peut favoriser la libération de l'hormone de croissance (GH) à partir de l'hypophyse antérieure. Il existe en 44 -, 40 -, ou un peptide acide 37-amino; sous la forme d'acide 44-amino peuvent être convertis en physiologiquement plus courtes formes. Ces trois formes sont signalés à être actifs, l'activité résidant principalement dans les 29 premiers acides aminés. Un peptide synthétique correspondant à la séquence d'acides aminés 1-29 de l'homme GRF GRF [(1-29)], aussi appelé Sermorelin, a été préparé par la technologie de l'ADN recombinant tel que décrit dans le brevet européen EP 105 759.

Sermorelin a été utilisé sous forme d'acétate pour le diagnostic et le traitement du déficit en hormone de croissance.

GRF a en effet une valeur thérapeutique pour le traitement de l'hormone de croissance de certains troubles connexes. L'utilisation de GRF pour stimuler la libération de GH est une méthode physiologique dans la promotion de la croissance des os longs ou anabolisme protéique.

Un problème lié à l'utilisation de GRF a trait à sa courte demi-vie biologique (environ 12 à 30 minutes). Le GRF (1-29)-NH2 est soumis à la dégradation enzymatique et est rapidement dégradée dans le plasma par dipeptidylpeptidase IV (DPP-IV) de clivage entre les résidus Ala2 et ASP3.

Il est donc avantageux de développer biologiquement stable, longue durée d'action analogues GRF par modification chimique spécifique de GRF, afin de prévenir ou de ralentir la dégradation enzymatique.

polyéthylène glycol (PEG) est un hydrophile, polymère biocompatible et non toxique de formule générale H (OCH2CH2) nOH, où n> 4. Son poids moléculaire peut varier de 200 à 20.000 Dalton.

Il a été démontré que la conjugaison chimique du PEG dans sa forme mono-méthoxylés aux protéines et / ou des peptides augmente considérablement leur durée d'action biologique. Comme fractions glucidiques dans une glycoprotéine, PEG fournit une couche protectrice et augmente la taille de la molécule, réduisant ainsi sa dégradation métabolique et son taux de clairance rénale.

conjugaison PEG est une méthode déjà établie pour les peptides et protéines de livraison au point par des études fondamentales de Davis et Abuchowski (Abuchowski et al., 1977a et 1977b). PEG conjugaison des peptides ou des protéines en général le résultat de l'attachement chimiques non-spécifiques de PEG à plus d'un résidu d'acide aminé. L'une des questions clés de cette technologie est donc de trouver des méthodes chimiques appropriées pour covalente conjugué molécule PEG (s) à certains résidus d'acides aminés.

Divers conjugués PEG-protéine ont été trouvées à l'abri de la protéolyse et / ou d'avoir une immunogénicité réduite (Monfardini et al., 1995, et Yamsuki et al., 1988).

Une approche a récemment été proposé pour la conjugaison spécifique au site de PEG à faible poids moléculaire des peptides, comme GRF, qui a été préparé par synthèse peptidique en phase solide. Dans ces conjugués d'un acide aminé pégylé, préparé à l'avance, a été introduite dans la séquence peptidique au cours de la synthèse en phase solide. Cette procédure, toutefois, complique considérablement la purification du produit qui est connu pour être l'étape critique de synthèse en phase solide. La présence de PEG, pour son poids moléculaire élevé et sa polydispersivity, est susceptible de donner des produits finis avec des impuretés inacceptables et / ou des produits de manque d'acides aminés, ce dernier étant considéré comme se produisant fréquemment à la procédure de Merrifield.

Mono-pegylation, ce qui signifie que seule une molécule PEG est jointe, en utilisant la synthèse en phase solide à certains résidus d'acides aminés de [Alal5]-GRF (1-29)-NH2 a été récemment rapportés dans la littérature (Felix et al., 1995 ). Cette étude montre que [Ala15]-GRF (1-29) NH2-pégylé à 21 ou 25 résidus conserve la pleine activité in vitro de la société mère [Ala]-GRJF '(L-29)-NH2. Il n'existe cependant pas de données in vivo pour démontrer si ces conjugués pégylé présentent une plus longue durée d'action à l'égard de la contrepartie non pégylé.

Plus récemment, il a été démontré (Campbell et al., 1997) que l'attachement de PEG avec différents poids moléculaires à l'extrémité C-terminale de plusieurs analogues du GRF, utilisant de nouveau en phase solide de synthèse, a renforcé la durée d'action dans les deux porcs et des modèles de souris par rapport à la contrepartie non pégylé.

EP 400 472 et EP 473 084 divulgue des dérivés PEG obtenus par l'utilisation d'instruments dérivés PEG activé. Dans les exemples aussi GRF on fait réagir avec de tels produits dérivés PEG activé, mais les particuliers GRF-PEG qui sont obtenus selon les demandes de brevet ne sont pas exactement identifiés, ni en aucune manière caractérisée. Il n'y a aucune mention d'un site de fixation spécifique PEG.

WO 99/27897 décrit un procédé pour la préparation spécifique au site de GRF-PEG conjugués contenant une ou plusieurs unités de PEG un (par GRF) lié de façon covalente à Lysl2 et / ou Lys2l et / ou Na, caractérisé en ce que la réaction de conjugaison entre le peptide GRF et du PEG activé est réalisée en solution et le conjugué souhaité GRF-PEG est purifié par des méthodes chromatographiques. Selon la demande de brevet tels le solvant a été sélectionné dans le groupe constitué d'une très concentré nicotinamide solution aqueuse, une solution aqueuse tamponnée d'un agent defolding (comme l'urée) ou un solvant organique polaire choisi parmi le diméthylsulfoxyde, diméthylformamide tampon / ou l'acétonitrile / tampon. diméthylsulfoxyde (DMSO) est principalement utilisé dans les exemples.

DESCRIPTION DE L'INVENTION Nous avons maintenant trouvé une amélioration de la méthode déjà décrite dans WO 99/27897, qui consiste en l'utilisation d'une classe spécifique de solvants, qui sera ici défini comme «la structuration des solvants". Une telle amélioration permet d'orienter la réaction presque totalement mono-pegylation vers le groupe S-aminés de Lysl2.

En fait, également sélectionner le bon rapport molaire PEG / GRF, selon la présente invention, il est possible d'obtenir jusqu'à 85% du conjugué GRF-PEG ayant de 1 molécule PEG lié de façon covalente au groupe S-aminés de Lysl2 à l'égard du montant total des espèces mono-pégylé. D'autres espèces mono-pégylé pourrait avoir été le conjugué GRF-PEG ayant de 1 molécule PEG lié de façon covalente au groupe S-aminés de Lys21 le conjugué GRF-PEG conjugué ayant de 1 molécule PEG lié de façon covalente au groupe amino primaire en Na.

Par conséquent, le mode de réalisation principal de la présente invention est une méthode pour la pégylation en phase liquide du GRF, qui permet d'obtenir régiosélectivement conjugué GRF-PEG ayant de 1 molécule PEG de façon covalente à la Lys groupe s-amino caractérisé en ce que la réaction est effectuée dans un solvant structuration.

Ceci et d'autres avantages du processus actuel de plus de ceux déjà décrits, en particulier dans WO 99/27897 peuvent être énumérés comme suit: un formulaire unique monopegylated du GRF, en large excès par rapport à l'autre forme monopegylated (s), peut être reproductible obtenus lorsque les conditions de réaction adéquates soient appliquées. Sélectivité de la pégylation en phase liquide de la procédure GRF a été considérablement améliorée, une réaction d'acylation régiosélective a été obtenue sans l'utilisation de la protection / déprotection des groupes, les rendements de réaction plus élevées sont toujours observées lors d'un excès de PEG activé réagit avec GRF. Même un excès de trois fois de PEG (chaîne 1PEG par groupe amine primaire disponible) ne conduit pas à la formation de plus de 10% de l'actif in vitro mal dipegylated forme GRF. Les principales espèces reste la forme monopegylated du GRF.

Selon cette invention, le terme «GRF", sauf indication contraire, est destiné à couvrir les peptides de l'homme GRF, avec une référence particulière à la 1-44,1-40, 1-29 peptides et des amides correspondants (contenant un groupe amide à l'extrémité N-terminale ou C-terminale). Le peptide préféré GRF est GRF (1-29)-NH2 "solvants structuration» ou «solvants structure de promotion" dans la présente invention est destiné à se référer à des solvants ou co-solvants qui sont capables de conférer la stabilité de la conformation dominante de un peptide ou une protéine. En général, ils sont des solvants organiques polaires, tels que les alcools, et sont connus pour être utilisés comme solvants ou co-solvants de peptides ou des protéines pour la RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) ou CD (dichroïsme circulaire) des études.

Parmi les alcools trifluoethanol (TFE) est préféré selon l'invention.

"N" dans la présente invention, le groupe aminé en position N-terminale du peptide (Tyr).

Le PEG "activé" (ou "pegylating agent») est une forme dérivée PEG, qui peut être utilisé comme modificateur de protéines, car il contient un groupe fonctionnel capable de réagir avec un groupe fonctionnel de la protéine / peptide de produire le PEG-protéine / conjugués peptide. Un examen des dérivés PEG utiles comme modificateurs de protéines peut être trouvée dans Harris (1985). Le PEG activé peut être un agent alkylant, tels que l'aldéhyde PEG, époxyde PEG ou tresylate PEG, ou il peut être un réactif d'acylation, tels que les esters de PEG.

Le PEG activé est utilisé de préférence dans sa forme mono-méthoxylés. Il a de préférence un poids moléculaire compris entre 2.000 et 20.000. PEG5 mono-méthoxylés, 000 est particulièrement préféré pour la préparation du PEG activé selon l'invention.

Si activé PEG est un agent d'acylation, il contient de préférence soit un norleucine ou ornithine résidu lié à la fraction PEG via une liaison carbamate. Ces résidus permettent une détermination précise des unités de PEG liés par mole de peptide (voir par exemple Sartore et al., 1991). Par conséquent, plus particulièrement, le PEG est activé préféré PEG mono-méthoxylés. 000 groupe lié au moyen d'une liaison carbamate à l'alpha aminés de norleucine, qui est activé au niveau du groupe carboxy sous forme d'ester succinimidyl.

Un autre PEG préféré peut être activé méthoxy-PEG-succinimidyl propionate («PEG-SPA»).

PEG ramifiés sont également d'usage courant. Le PEG ramifié peut être représenté comme R (-PEG-OH) m dans laquelle R représente une fraction de noyau central tels que le pentaérythritol ou de glycérol, et m représente le nombre de ramification des armes. Le nombre de ramification des armes (m) peut varier de trois à une centaine ou plus. Les groupes hydroxyles sont soumis à des modifications chimiques.

Une autre forme ramifiée, telle que celle décrite dans le brevet PCT WO 96/21469 application, a un point d'arrivée unique qui est soumis à des modifications chimiques. Ce type de PEG peut être représenté comme (CH30-PEG-) PR-X, où p est égal à 2 ou 3, R représente un noyau central comme la lysine ou de glycérol, et X représente un groupe fonctionnel tel que carboxyle qui est assujettie à des agents chimiques activation. Pourtant, une autre forme ramifiée, le PEG «pendant», a groupes réactifs, tels que carboxyle, le long de la colonne vertébrale PEG plutôt qu'à la fin des chaînes de PEG.

Toutes ces PEG ramifié peut être «activé», comme indiqué ci-dessus.

"Pegylation" est la réaction par laquelle un conjugué PEG-protein/peptide est obtenu à partir du PEG activé et la protéine correspondante / peptide.

Le rapport molaire PEG: GRF peut être de 1: 1,2: 1 ou 3: 1, mais 3: 1 est préféré selon la présente invention.

La température est maintenue autour de la température ambiante.

Même dans ce cas, comme pour le procédé décrit dans WO 99/27897, le pegylation de la présente invention augmente la résistance à la dégradation protéolytique, n'affecte pas, ou peu diminue, l'activité biologique, selon la mesure de pégylation et permet d'obtenir des produits (conjugués), qui sont plus solubles dans des solutions aqueuses tamponnées.

La présente invention a été décrite en référence aux modes de réalisation spécifiques, mais le contenu de la description comprend toutes les modifications et les substitutions, qui peut être introduit par une personne du métier sans sortir du sens et le but des revendications.

L'invention va maintenant être décrite au moyen des exemples suivants, qui ne devrait pas être interprétée comme une limitation quelconque à la présente invention. Les exemples se référeront aux chiffres cités ci-dessous.

DESCRIPTION DE LA Figures Figure 1: il rend compte de la structure semi-développée pour les deux DEP est activé, qui ont été utilisées dans les exemples.

Abréviations EXEMPLES ACN Acétonitrile DMSO diméthylsulfoxyde GRF l'hormone de croissance facteur de libération de CLHP chromatographie liquide à haute performance IEX d'échange d'ions MPEG-Nle-Osu Monomethoxypoly (éthylène glycol)-norleucine ester en phase inverse RP succinimidyl TEA triéthylamine TFA acide trifluoroacétique TFE Trifluoroethanol (2,2,2 -trifluoroéthanol) Prelimi7larv RMN 07L GRF GRF est membre d'une famille de peptides qui sont connus pour être caractérisé par une structure secondaire prédominante en hélice, en particulier en présence de solvants comme le méthanol et trifluoroéthanol dans des solutions aqueuses (voir Clore et al. , 1986, et Thériault et al., 1988).

études de RMN supplémentaires ont été plus récemment Fait à Lima (Bioindustry Park, Ivrée, Turin, Italie). Un des principal objectif était de mieux faire comprendre l'influence des solvants sur la structure GRF, et pour évaluer et éventuellement de solvant dépend des changements conformationnels de la lysine 12 et la lysine 21 chaînes latérales, des changements qui pourraient modifier la réactivité chimique des groupements amine.

Ces études ont montré que la structure de GRF dans le DMSO est mal structuré et highlyfluxional.

D'autre part, dans le mélange méthanol / eau 75%, le repliement global de GRF se composait de deux domaines hélice rejoint par un coude bien défini, ce qui fait un angle d'environ 90 ° entre les axes des hélices.

En trifluoroéthanol soignée, les études RMN montrent une structure secondaire de GRF essentiellement une hélice à toutes les températures en considération lorsque les 2 secteurs de co-hélice, sont reliés par un segment central flexible.

Une différence majeure avec la structure du mélange MeOH/H20 75%, est que ce segment joignant les deux par-hélices, existe dans des conformations multiples et dépend fortement de la température.

D'autres études faites à différentes températures avec TFE a montré que les voies de seconde hélice (fragment 18-28) est plus stable que la première (fragment 4-14).

Les études ont montré que TFE améliore encore la stabilité hélices a déjà observé dans le méthanol / eau 75/25 mélange. Cette stabilisation semble induire un désordre conformationnel dans la partie de la molécule (centrée sur fragment 16-19) les rejoignent.

Cet effet structurant du TFE apparaît comme un élément clé de l'orientation possible de la réaction PEGylation.

Cet effet structurant du TFE apparaît clairement comme un élément clé pour l'orientation possible de la réaction PEGylation.

Matériel et réactifs Lot n ° Description GRFl 29 (Bachem) FGRF1299603 Methoxy-PEG-Nle-Osu (Shearwater polymères) PT-028-12 méthoxy-PEG-succinimidylpropionate (SPA), 85969 (Fluka) trifluoroéthanol (TFE), (Aldrich) , spectrophotométrique ofsvnthesis Note générale naethod Pour GRF-29 poudre en vrac est ajouté à la fois à trifluoroéthanol. Dissolution se produit rapidement à température ambiante sous agitation douce jusqu'à [GRF] = 20 mg / ml dans le trifluoroéthanol (TFE).

Le choix du réactif activé PEG est ensuite ajoutée sous agitation à la fois sous forme de poudre sèche, ou en solution TFE, pour atteindre final PEG: GRF ratios molaires de 1: 1,2: 1, ou 3: 1 (3: 1 est le ratio préféré un).

Le mélange réactionnel est ensuite agité à température ambiante pendant un minimum de 6 heures. Trifluoroethanol est ensuite évaporé sous vide (30 ° eau de bain C, 60 mTorr à vide) et le mélange réactionnel stockés à-80 ° C avant la purification.

Résultats Le mélange réactionnel trempe du GRF, monopegylated, et les espèces dipegylated, est analysé par CLHP en phase inversée et le rendement de chaque espèce déterminée en pourcentage de la superficie. Le ratio respectif de ces deux espèces monopegylated à Lysine 12 et Lysine 21 est déterminée après purification du matériau brut et dans l'analyse des processus par HPLC en phase inverse.

Le tableau 1 montre les résultats obtenus à différentes rapport molaire du PEG et du GRF dans le DMSO et TFE.

TABLEAU 1 PEGylation des rendements de réaction GRF et le rapport. dans le DMSO dans le TFE PEG: GRF 1: 1 1,5: 1 2: 1 1: 1 2: 1 3: 1 fois molaire de réaction ratio H 3 22 3 3 3 22 22 6 GRF qui n'ont pas réagi 32 33 19 4 70 58 35 26% * GRF% PEG-1 * 48 48 51 20 25 37 53 65 GRF-2PEG (*%) _ 20 19 30 74 5 5 12 9 GRF-IPEG-Lys 50 47 48 96 96 96 96% a% * des moyens de pourcentage de poids % dans le produit final de réaction en pourcentage en poids moyen de GRF-1-PEG Lys'2 à l'égard du montant total GRF-lPEG-Lysl2 + GRF-lPEG-Lys21.

«GRF-1 PEG" se réfère à la quantité totale des espèces mono-pégylé »GRF-2PEG» désigne le montant total des espèces Commentaires di-pégylé aux résultats du tableau 1 un rendement maximal de 51% du GRF-1PEG-5K a été obtenue en présence de DMSO, le rendement, qui réduira considérablement (de 51 à 20%) dans un excès de double de PEG. Au contraire et tout à fait inattendue, un excès double de PEG par rapport GRF en présence de TFE augmente le rendement du GRF-1PEG. La même observation peut être faite avec un excès de trois fois de PEG.

Cet exemple constitue l'une des principales différences entre les processus dans le DMSO et TFE. La réaction produit TFE d'une manière régiosélective à la formation quasi-exclusif du GRF pégylé en position 12.

Le tableau 2 indique le rapport dans la zone% obtenus en RP-HPLC des différentes espèces du mélange réactionnel dans deux solvants, le diméthylsulfoxyde et trifluoroéthanol, à des taux différents, et avec deux PEG activé différentes avec le même ester succinimidyl réactifs (voir Figure 1) .

TABLEAU 2 Comparaison des rendements et le ratio des différentes espèces obtenues au cours de pégylation GRF dans le DMSO et la solution de TFE. dans le DMSO dans le TFE PEG-Nle PEG-SPA PEG-Nle PEG-PEG-SPA SPA PEG-Nle PEG PEG-SPA: GRF 1: 1 1: 1 1: 1 1.1 2: 1 3: 1 4: 1 Réaction ratio molaire temps (h) 3 3 24 24 24 24 24 n'ayant pas réagi GRF 32 31 53,9 51 34,6 26,2 5,5 (*%) GRF-1PEG PEG 48 48,9 43,6 45 57 65 64 GRF-2PEG (*%) 18 16 2,5 3,3 8,6 8,6 30,1 GRF -1 PEG-Lys 45 45 75 79 80 82. * 7 85% b% des moyens en pourcentage en poids dans le b% du produit final de réaction moyen en pourcentage en poids de GRF-lPEG-Lys »à l'égard du montant total monopegylated GRF formes.

Commentaires sur les résultats de Sable 2 Des résultats comparables sont obtenus avec PEG soit activé. La réaction en l'absence de thé, de procéder à une sélectivité différente dans le TFE. En présence d'un excès de trois à 4 - pli de PEG, 50% des espèces GRF-lPEG-Lysl2 est formé, deux fois plus que le montant maximal obtenu dans le DMSO. Les résultats obtenus avec un PEG: ratio GRF sont les meilleurs résultats obtenus dans les conditions testées.

Conclusions PEGylation du processus de GRF en plomb TFE à la formation d'une espèce majeure, le GRF-lPEG-Lysl2. L'utilisation de TFE comme solvant de réaction a été montré pour augmenter la sélectivité de la pégylation. TEA en tant que nucléophile Enhancer oriente le positionnement des chaînes de PEG sur le peptide GRF.

Soutenu par l'effet structurant de TFE sur GRF-29 amide (données de la RMN), les avantages possibles de ce processus au cours du processus dans le DMSO sont nombreuses et peuvent être résumées comme suit: # une réaction d'acylation régiosélective a été obtenue sans l'utilisation de la protection / déprotection des groupes; # rendements plus élevés de monopegylated GRF ont été obtenues expérimentalement en présence de TFE, à l'égard de la réaction dans le DMSO, une production à grande échelle de la forme monopegylated de GRF bénéficieront des avantages décrits dans ce protocole.

Références Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 252,3571-3581,1977 a; Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 252,3582-3586,1977 b; Campbell R. et al. Res Peptide J.., 49,527-537,1997; GM Clore et al., J. Mol. Biol., 191,553-561 (1986).
 

[berurier 739]

merci de ton post, je vais l'epingler